快速衰老模型——SAMP8 Mice

一、品系名称

品系名称：SAMP8 Mice

别名：SAMP-8, SAM-P/8, SAM-P8

毛色：白化

编辑类型：自发突变

疾病相关：阿尔茨海默症

遗传背景：AKR/J，疑似杂交了未知品系

繁育方式：近交繁殖或体外受精，

二、衰老动物模型

人类衰老机制研究和抗衰老药物筛选的重要手段是选择合适的衰老动物模型。应用衰老动物模型对AD进行实验研究具有一定的代表意义。在实验研究中应用的衰老动物模型主要有自然衰老动物模型和快速老化动物模型。

　　 自然衰老模型 

　自然衰老动物模型是通过对1~2月龄的大小鼠日常维持饲养到小鼠18~24月龄、大鼠24月龄基本相当于人类56 ~ 70岁来构建衰老动物模型。自然衰老动物模型建模简单，在衰老期时出现脑内神经元变性、胆碱能功能降低、感觉、行为和记忆障碍等与临床患者相似的各种病理特征。因此，在AD研究中自然衰老动物模型作为首选动物模型。

　但自然衰老模型的缺点是建模时间较久，一般情况下要饲养15个月以上（虽可以直接购买适龄动物，但成本非常高），由于在建模过程中饲养时间过长，投入的人力和物力成本相对较大，另外，在饲养过程中感染其他疾病机率也相对较高且健康状态较差，特别是进入老龄期后容易死亡，在后期样本检测中个体差异大。

　　 快速老化模型 

　　日本京都大学竹田俊男教授在 1968 年培育出快速老化小鼠（SAM），在此基础上又于 1975 年培育出易快速老化系小鼠（SAMP）和抗快速老化系小鼠（SAMR）。其中 SAMP8 小鼠在学习记忆减退、神经递质改变、APP代谢异常、Aβ沉积等方面表现出与年龄相关的AD临床特征，一致认为是研究 AD 最好的动物模型。

　　SAMP8小鼠的一般生存时间为12-13个月，在6个月龄之后进入老化加速期。在月龄相同情况下，SAMR1小鼠表现出抗痴呆特征，在实验研究中一般作为SAMP8 鼠的对照。快速老化小鼠具有饲养周期短，衰老特征明显的优点，但快速老化小鼠相比其他模型小鼠价格较贵，且SAM 动物繁殖能力较弱，相对来源较少，具有一定的局限性。

三、起源

1968年，美国(Bar HarberME)JAX赠送给日本京都(Kyolo)大学几对AKR/J系小鼠。在繁殖饲养过程中，Takeda等人发现有几窝小鼠表现有程度

不同的脱毛、皮肤粗糙、白内障、行为障碍及生存期缩短等现象，且具有遗传倾向，1975年，他们精心挑选了5窝表现明显衰老的AKR/J小鼠作为P系祖先，表现有正常衰老过程的小鼠作为R系相先。选择P系、R系的主要标准是以老化度评分(在8月龄时衰老程度)、生存期限及与衰老相关疾病的病理学改变为依据。根据生存曲线(Gompertzian function)及老化度评分标准得出P系小鼠的衰老特征为快速老化。因此，P系称为快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse/prone，SAMP)，R系称为抗快速老化小鼠。

SAMP在渡过一段正常生长期(4～6月龄)后迅速出现行动反应迟缓、被毛光泽减退、脱毛、皮肤溃疡、眼周损害、角膜溃疡、白内障、脊柱弯曲等老化特征。SAMR表现为正常衰老，一般作为SAMP的正常对照。快速老化痴呆模型小鼠SAMP8是SAMP系中的一个亚系，主要以学习、记忆能力障碍为老化特征，是目前公认的比较理想的自然衰老痴呆模型。此后，除维持兄妹交配外，根据其衰老等级分值、寿命和病理表型进行选择性地繁育，繁育出9个P系即P1、P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10和P11，3个R系即R1、R4和R5。各系小鼠有不同的特征性病理表现。SAMP8小鼠寿命一般为12-13个月。统称SAMP和SAMR系为快速老化小鼠。8月龄时SAMP的老化度评分为7.97，为SAMR的2倍(3.94)。SAM属近交系小鼠，增龄过程中出现许多与衰老相关的功能紊乱，如免疫功能紊乱，肺泡扩张，听力损伤，退行性骨关节炎，骨质疏松，伴有或不伴有脑萎缩的学习记忆功能障碍等。迄今为止，SAM己被广泛用于衰老相关性疾病及分子机制的研究。

四、特征/用途

1、神经病理

SAMP8在增龄过程中脑内有大量Aβ沉积，Northern杂交法检测表明，β淀粉样蛋白前体(APP)mRNA表达水平无明显变化。从4到12月龄，海马区Aβ增加，但没有刚果红 (Congo red)或硫磺素 (Thioflavine S)染色的类斑块结构。海绵状变性：脑干神经元突触间隙中大小不同的空泡 (Yagi et al., 1989)。小胶质细胞增生 (Amano et al., 1995)。在黑质多巴胺神经元和蓝斑去甲肾上腺素神经元中发生退化 (Karasawa et al., 1997)。

2、认知/行为

SAMP8在增龄过程中出现的学习记忆功能障碍与脑内相应神经递质改变密切相关，如大脑皮层和海马部位乙酰胆碱(Ach)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)降低及阿片肽、Y-氨基丁酸(GABA)升高，5-羟色胺(5-HT)表现为先升高后降低等。

与年龄相关的行为障碍，包括学习和记忆困难 (Miyamoto et al., 1986)，情感障碍，如减少的类焦虑行为和抑郁行为 (Miyamoto et al., 1992)，以及自发运动和饮水的昼夜节律发生改变 (Miyamoto, 1997)。

3、免疫

SAMP8在2月龄时就出现免疫功能异常，对绵羊红细胞(SRBC)诱导的脾细胞抗体生成反应、Con A诱导的淋巴细胞增殖反应及IL-2产生能力均明显下降。进一步研究发现，SAMP8脾脏CD+4细胞数目及功能下降，NK细胞数量正常。用免疫增强剂后，NK细胞活性明显增强，表明NK细胞活性降低可能与IL-2水平下降有关。

用途：研究衰老与学习记忆功能及学习记忆功能障碍发生机制和评价益智药物的良好动物模型，而且是研究神经内分泌免疫调节网络平衡的良好模型。

SAMP8还有以下形态学特征：

1.以脑干为中心出现海绵状变化 

 SAMP8在幼龄时脑组织即出现海绵状变化，对照组R1小白鼠几乎见不到。如2月龄后以脑干、延髓的网状结构为中心，出现许多空泡性变化并呈海绵状。空泡定量分析表明，空泡的大小和数目伴衰老增加，且与学习记忆缺陷的程度密切相关。用胶质细胞纤维酸性蛋白 (GFAP) 染色,早期可见伴有大量的和广泛的星形细胞增生。空泡性变化在8个月时其峰值下落，至老龄则不明显。

2. 海马锥体细胞的树状棘密度的减少

     Golgi染色和组织定量研究表明，SAMP8海马锥体细胞树突棘的密度发生了明显的异常变化，与对照组R1相比，CA1和CA3 棘的密度明显减少。说明进入该部位的锥体细胞突触减少。考虑到海马是记忆的重要结构，因此SAMP8的学习记忆障碍与此异常具有直接关系。

3. 增龄引起明显的星形细胞增生

     SAMP8发育早期即出现星形细胞的增生。应用 GFAP 染色观察, 2月龄即可看到斑状的星形细胞增生，推测这可能是对海绵状变化的修复反应。增生发生于多个脑区，最明显的部位与脑干海绵样病变一致。另外，光学显微镜显示海绵状变化不明显的其他部位，如大脑皮质的一部分、纹状体、大脑基底部、脑干背侧等也出现GFAP阳性星形细胞的增加。在上述相应部位, 对照组R1只在高龄时观察到显著的星形细胞增生，可能是增龄神经细胞脱落、突触变性等多种多样的原因所造成。但是，梨状皮层与其他皮层相比，随增龄的星形细胞增生是比较多的部位，同时出现随增龄皮层变薄的倾向。

4. 多发PAS(希夫过碘酸)染色阳性颗粒状结构

     SAMP8 PAS染色阳性颗粒状结构(PAS-positive granular structure, PGS)在脑内分布最常见的部位是海马、梨状皮层、嗅结节和小脑皮层等，特别是海马的CA1、CA2和CA3最多。海马的组织定量研究结果表明，PGS在SAMP8系的3月龄左右可以看到，6月龄后随增龄急速增加。其具体变化过程是，自3月龄开始，PAS阳性颗粒出现于突触后，进一步可见丘脑以及属于边缘系统的梨状区神经核群发生变化。而对照组R1，只出现于少数老龄鼠。SAMP8平均寿命约为R1的一半，即使考虑平均寿命误差，SAMP8 PGS的增加也非常显著。因此PGS的出现及早期多发是其特异点之一。
    PGS在老龄鼠的脑内怎样形成仍然是个谜。PGS的特点是一个由数十个颗粒状小体组成的聚集体，用GFA/PAS双重染色，常常在聚集体的中央观察到GFA阳性星形细胞，PGS簇集的大小正好和星形细胞突起延伸一致，一个个小体沿着突起分布。但是也可以考虑这是星形细胞的单纯的反应表现，很可能PGS的形成过程与星形细胞有关。
    迄今为止，还没有人和其他动物关于PGS的报告。PGS是SAM新的形态学脑老化指标，同时又在学习记忆障碍的SAMP8多发。

5.血脑屏障的异常

       血脑屏障(blood-brain barrier, BBB) 是由毛细血管形成的血浆与脑细胞外液间的屏障，可防止多种外源物质进入脑，但营养物质和代谢产物可顺利通过, 保护脑的内环境高度稳定, 以利于中枢神经系统的机能活动。随着中枢神经系统的老化，BBB的机能低下，导致外源物质易于侵入，出现脑损害。日本学者观察了SAMP8和R1出现增龄血脑屏障的变化，尤其是内侧海马、背侧丘脑和嗅球。

       SAMP8大脑没有表现出被视为阿尔茨海默病（AD）病理特征的形态学变化（即神经原纤维缠结和老年斑）；然而，SAMP8大脑显示出AD的一些病理生理特征，即Aβ异常积聚和Aβ清除受损、tau蛋白过度磷酸化、氧化应激增加和胶质增生。基于目前的突变相关AD模型，很难确定老年人群中可以从该疾病中读取的事件的时序。因此，SAMP8小鼠可能是研究与AD相关的最早神经退行性变化的极好模型，并为人类疾病提供了更全面的图景——一种由与年龄相关的事件引发的综合征。

五、SAMP8小鼠应用研究现状

1、行为学特征

神经行为学实验是研究动物学习记忆力障碍的主要方法。其方法主要有水迷宫、明暗箱、跳台等。基本原理是利用动物觅食、求生、逃避伤害等本性设计实验，观察其近期和远期学习记忆能力。Chen等用六臂水迷宫对SAMP8鼠进行行为学测试，发现在3个月时出现空间学习缺陷，5个月时出现空间记忆缺陷。SAMP8小鼠随月龄增长学习记忆能力逐渐减退;与同龄对照组相比，8、12月龄SAMP8小鼠出现明显衰老特征，表现出学习记忆能力明显低下。由于各实验室采取的实验方法不同，在评估学习记忆力障碍发生的时间上报道不一致，但一般均认为，与正常老化的R1鼠相比，SAMP8鼠在8月龄出现明显的学习记忆障碍。选择2，6，10个月的SAMP8和SAMR1鼠用高架十字迷宫、旷野实验、黑白巷、食物恐新实验研究鼠的焦虑行为，发现在高架十字迷宫、黑白巷实验中年龄的作用是很明显的。高架十字迷宫实验显示SAMP8鼠随年龄增加焦虑行为增加。10个月雄性SAMP8鼠有更明显的焦虑行为。

2、形态学特征

SAMP8鼠的一些形态学特征已有相关报道：以脑干为中心出现海绵状变化；海马锥体细胞的树状棘密度减少；海马、梨状皮质、嗅结节和小脑皮质等多发部位PAS(希夫过碘酸)染色阳性颗粒状结构；伴加龄出现血脑屏障(BBB)障碍。为了阐明SAMP8鼠海马BBB水平，选择3，7，12个月SAMP8和SAMR1检测脑内源性IgG的外渗，发现12个月P8鼠IgG 有明显的外渗，提示老龄SAMP8鼠BBB渗透性增加。另有学者报道，通过免疫组织化学方法用髓磷脂碱性蛋白(MBP)和2，3-环状核苷酸3-磷酸二脂酶(CNP)作为少突胶质细胞标记研究SAMP8鼠脑内少突胶质细胞的变化发现：在10个月，SAMP8鼠海马CA1与SAMR1鼠比较，MBP和CNP免疫反应阳性细胞明显减少；而在10个月鼠龄大脑皮质和视神经束的MBP和CNP没有明显不同。结果显示在SAMP8鼠海马少突胶质细胞有随增龄的退化。

3、脑内物质代谢异常

自由基对神经细胞的损伤可能是痴呆发病的主要原因之一。一氧化氮是一种不同于经典神经递质的信息递质。一氧化氮由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸产生。Colas等[8]用RT-PCR和生化技术观测SAMP8鼠和SAMR1鼠，随着年龄的增加，2个品系分别在8~12个月、2~8个月，在皮质和海马nNOS的水平下降。在脑干，SAMP8鼠中nNOS mRNA下降，而在SAMR1鼠没有下降。更重要的是，发现海马区nNOS的活性在8个月SAMP8鼠比SAMR1鼠低，而在SAMP8鼠和SAMR1鼠的皮质和脑干，nNOS活性在8个月时增加然后随着增龄下降。Sureda等研究发现，5个月的SAMP8鼠与SAMR1鼠的皮质比较，谷胱甘肽还原酶和过氧化物酶降低；用免疫印迹测得在雄鼠比雌鼠过氧化氢酶活性降低，这与过氧化氢酶低表达有关；神经细胞染色显示在老的SAMP8鼠脑皮质神经细胞缺失，且发现在皮质细胞凋亡蛋白酶和钙蛋白酶活性增加；用免疫染色也观察到tau相关蛋白的形态学改变，预示结构功能的形态改变。

SAMP8鼠阿尔茨海默病的特征性蛋白-淀粉样前体蛋白(APP)的表达也随增龄显著增加。免疫组织化学分析表明，海马中淀粉样蛋白斑的产生需要APP的表达达到一定的临界量，认知能力的获得与维持的缺陷可通过在脑室中注射β-APP抗体而减轻，说明β-APP的产生与认知能力的缺陷有关。Morley等研究表明脑室内注射β-淀粉样蛋白单克隆和多克隆抗体可以改善学习和记忆缺陷，对痴呆相关疾病的治疗提出了希望。SAMP8小鼠海马8-氧鸟嘌呤核苷(8-oxo-G)的表达除1月龄外随月龄增加而增加，提示8-oxo-G的表达增加与SAMP8小鼠的快速老化相关，有可能为增龄，甚至阿尔茨海默病的生物学标志[13]。电压门控Na+通道Ⅱ型(SCN2b)参与了海马和额叶正常生理功能的维持，其在额叶随月龄增加的表达变化可能与衰老、认知记忆功能的减退有关。

4、激素变化

Landfield曾提出了糖皮质激素致脑老化学说。Flood等报道，SAMP8鼠在增龄过程中血浆睾酮水平明显降低，8月龄时血浆睾酮水平下降43%(与4月龄相比)，12月龄时下降71%。如果外源性给予12月龄SAMP8鼠生理剂量睾酮与同月龄SAMP8鼠相比，可明显改善其被动回避反应，认为睾酮改善学习记忆可能与其在脑内经芳香化酶作用转变为雌激素，雌激素又促进了DA能神经元的功能有关。

5、神经营养因子变化

Miyazaki等通过RT-PCR、免疫组织化学等技术对SAMP8鼠、SAMP10鼠、SAMR1鼠进行有关胶质源性神经生长因子(Glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)方面研究，先检测了3个品系海马区GDNF mRNA表达。GDNF mRNA表达在SAMR1鼠下降，RT-PCR数据密度分析显示10个月龄的GDNF表达是2个月龄表达的50%，而5个月表达是2个月龄表达的69%。在SAMP8鼠和SAMP10鼠没有依赖年龄的GDNF mRNA表达不同；另一方面，在大脑皮质、脑干和其他区域没有GDNF mRNA的改变。在2月龄的海马，SAMP8鼠(约为对照组的49%，P < 0.05)和SAMP10鼠(约为对照组的41%，P < 0.05)GDNF mRNA的表达明显比同龄SAMR1鼠低。然而，在10个月，SAMP8鼠表达与SAMR1鼠没有不同，SAMP10鼠也无明显下降。在SAMP8鼠和SAMP10鼠CA1区的锥体细胞层较薄，显示CA1区锥体细胞层神经元数量的下降，没有见到神经元与年龄有关的形态学改变。3个品系海马CA1区生存神经元的数目表现为，在10月龄的SAMP8鼠和SAMP10鼠比2月龄下降约77%(P < 0.01)，比10个月的SAMR1鼠也下降。在SAMR1系没有随年龄的变化。结果表示幼鼠SAMP8和SAMP10低GDNF表达可能在海马功能障碍方面(如与年龄相关的学习损害)起重要作用，而在老龄鼠海马诱导神经死亡。

6、SAMP8小鼠学习记忆功能受恐惧、咀嚼和饮食影响

据报道，用SAMP8鼠和SAMR1鼠研究恐惧条件下学习和认知的缺陷。鼠被限制在特殊的实验箱内，小鼠脚下有一个振荡器制作紧张。条件形成后，对没被紧张因素干预的小鼠和不同程度紧张因素干预的小鼠在非紧张条件下检测，结果显示SAMP8鼠被紧张因素干预后有学习和记忆缺陷。老龄鼠无臼齿可以引起海马CA1区树突棘数目的下降，表现为学习能力下降。老龄SAMP8鼠牙齿咬合失调时间越长，空间学习能力缺损越严重，海马CA3区神经元数量下降越明显。大鼠或小鼠的牙齿缺除损害空间记忆的获得，表明咀嚼活动的减少可导致神经网络功能的改变。饲喂不同食物对SAMP8鼠的智力衰退也有影响。如断奶期后软食饲喂减少大脑皮质突触形成，损害成年期间空间学习能力。用磷脂酰胆碱加维生素B12饲喂SAMP8鼠可提高脑中蛋白激酶C的活性，增强学习能力。给动物正常食物40%的能量来限制饲喂SAMP8鼠，可有效抑制老化过程中与智力衰退关联的异常。

7、SAMP8小鼠在评价改善学习记忆功能药物及中医方面的应用

SAMP8鼠由于具有典型的学习记忆功能衰退及老化症状，而被用于评价和干预老化关联的疾病和改善学习记忆机能的药物。传统中药六味地黄汤通过修饰一些基因的表达明显提高SAMP8鼠中枢神经系统的认知功能。SAMP8鼠在增龄过程中血浆及中枢海马、皮质内皮质酮水平明显高于对照。血浆皮质酮水平升高可降低海马神经元细胞内ATP水平，并诱导兴奋性氨基酸堆积，口服六味地黄汤可显著降低血浆皮质酮水平，同时使海马ATP、ADP、AMP水平升高，从而改善SAMP8鼠的学习记忆功能。在体内研究中，用3个月的SAMP8鼠给予4种不同饮食，结果显示补充提取物饮食的鼠比对照组有少的淀粉样蛋白沉积和低水平硫代巴比土酸物质水平。Mak等给SAMP8鼠喂养银杏叶提取物或蔗糖3周直到3或9个月时处死。喂银杏叶提取物的9个月鼠海马Bax/Bcl-2表达率明显低于喂蔗糖鼠Bax/Bcl-2表达率。

然而，在大脑皮质区没有明显的不同。银杏叶提取物组明显下降，对海马衰老有保护作用，进一步降低细胞凋亡。免疫印迹法证实了短期后Bax的下降和高剂量银杏的治疗作用。推测银杏叶提取物可能通过调节海马Bax和Bcl-2的不同表达抵抗凋亡作用。Yang等探讨“益智健脑粒浓缩液”对SAMP8鼠海马神经元、行为和凋亡基因bcl-2，bax的作用，进一步探讨传统中药YCF(yizhi jiannao granule concentration fluid)对提高学习和记忆的分子机制。结果显示，在YCF组，逃避潜伏期明显缩短，扇形平台游泳时间明显增加，海马神经凋亡率下降，Bcl-2水平和Bcl-2/Bax增加，Bax下降。得出结论：益智健脑粒能降低神经元凋亡率和Bax水平，增加Bcl-2水平，调节Bcl-2/Bax，这可能是益智健脑粒抑制凋亡作用、提高学习和记忆的部分机制。黄连解毒汤喂养的SAMP8鼠海马和大脑皮质62种基因表达的改变提出黄连解毒汤缓解认知缺陷作用是通过多种机制、多靶点实现的。用褪黑素皮下注射治疗4个月和7个月的SAMP8鼠，结果显示褪黑素在提高学习记忆能力的同时明显提高海马锥体细胞的数量，而4个月的SAMP8鼠表现更明显，提示褪黑素对SAMP8海马的保护作用有年龄依赖性。用SAMP8鼠研究“益气调穴扶本培元”针刺的作用，针刺诱导SAMP8鼠不同脑区细胞的增殖，新生细胞连续分布在海马槽的背面，从侧脑室延伸到胼胝体，揭示了针刺提高认知缺陷的机制。用乌龙茶、绿茶喂养6个月的SAMP8鼠16周，乌龙茶、绿茶能降低SAMP8鼠的认知缺陷、降低鼠脑的退行性变和衰老进程，可能与茶潜在的抗氧化应激有关。

六、饲料

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